• Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Chimie si Petrochimie – ICECHIM, Bucuresti, responsabil proiect dr. Diana Constantinescu-Aruxandei
• Enpro Soctech Bucuresti, responsabil proiect dr. Florentina Georgescu
• Norwegian Institute for Water Research – NIVA, Oslo, responsabil proiect dr. Steven Brooks
• Norgenotech, Skreia, responsabil proiect dr. Sergey Shaposhnikov

• Au fost realizate si testate modelele si procedurile experimentale necesare pentru prepararea si caracterizarea NaDES pe baza de polioli. S-au preparat amestecuri eutectice binare care contin clorura de colina: etilenglicol in raport molar 1:2, clorura de colina: 2,3-butandiol in raport molar 1:2, clorura de colina : 1,4 butandiol,  precum si amestecuri eutectice ternare (cu apa). NaDES obtinuti au fost caracterizate prin spectroscopie RMN si FTIR,  prin determinarea proprietatilor fizico-chimice si a stabilitatii in timp.

• NaDES selectati au fost utilizati pentru extragerea asistata enzimatic a acidului ferulic din biomasa lignocelulozica. In conditiile experimentale testate,  clorura de colina: 2,3-butandiol:apa 1:2:1 s-a dovedit a avea cea mai ridicata eficienta. Acidul ferulic extras a fost caracterizat din punct de vedere al activitatii antioxidante.

• A fost selectat un consortiu de Trichoderma cu actiune de biostimulare a plantelor de cultura, constituit din tulpinile de Trichoderma harzianum Td50b, NCAIM (P) F 001412, si Trichoderma asperelum Td36b,  NCAIMP (P) F 001434 si bacteria compatibila Paenibacillus graminis FL400, NCAIM (P) B 001365, tulpina producatoare de 2,3 butandiol. Tulpinile au fost folosite pentru realizarea unui proces secvential simultan de zaharificare si fermentare.

• In aceasta etapa s-au elaborat si realizat  ME pentru determinarea efectelor biostimulantilor microbieni (consortiu Trichoderma, P. graminis) asupra plantelor de tomate crescute in conditii controlate.

• Au fost realizate si testate modelele si procedurile experimentale necesare pentru prepararea si caracterizarea NaDES pe baza de polioli. S-au preparat amestecuri eutectice binare care contin clorura de colina: etilenglicol in raport molar 1:2, clorura de colina: 2,3-butandiol in raport molar 1:2, clorura de colina : 1,4 butandiol,  precum si amestecuri eutectice ternare (cu apa). NaDES obtinuti au fost caracterizate prin spectroscopie RMN si FTIR,  prin determinarea proprietatilor fizico-chimice si a stabilitatii in timp.
• NaDES selectati au fost utilizati pentru extragerea asistata enzimatic a acidului ferulic din biomasa lignocelulozica. In conditiile experimentale testate,  clorura de colina: 2,3-butandiol:apa 1:2:1 s-a dovedit a avea cea mai ridicata eficienta. Acidul ferulic extras a fost caracterizat din punct de vedere al activitatii antioxidante.
• Tulpinile au fost folosite pentru realizarea unui proces secvential simultan de zaharificare si fermentare alcatuit din urmatoarele etape: adaugarea peste suspensia de material lignocelulozic ultra-omogenizat a 2 parti inocul fungic peletizat, care contine tulpini biostimulante de Trichoderma, si incubarea timp de 72 ore sub agitare, la o temperatura de 35°C; separarea supernatantului si utilizarea supernatantului pentru fermentare cu  tulpini de Paenibacillus, pentru a produce de (2R,3R) 2,3 butandiol; separarea (2R,3R) 2,3 butandiol de mediul de cultura prin distilare extractiva cu acid oleic si uscarea suspensiei ramase in blazul de distilare, care contine bacterii formatoare de endo-spori, prin pulverizare, la o temperatura de intrare de 140-150°C si la o temperatura de iesire de 80-85°C.  S-a testat efectul biostimulant al consortiului de Trichoderma asupra acumularii de compusi bioactivi in plantele de Passiflora caerulea.
• Posibilitatile de transfer tehnologic au fost fundamentate prin studii de fezabilitate si de ciclu de viata.  Studiul de fezabilitate s-a realizat pentru procesul de  integrat de biorafinare in doua trepte, de 1000 tone pe an 2,3 butanediol, cu o investitie de 20,98 milioane euro. Veniturile anuale estimate pentru o astfel de capacitate sunt de  circa 5800 mii euro, cu o marja bruta de 44%. Desi reprezinta numai 33% din valoarea estimata a veniturilor, biopreparatele pe baza de biostimulanti microbieni pentru plante sunt necesare pentru asigurarea sustenabilitatii si o ecoeficientei.

• O multitudine de NaDES au fost sintetizatii prin combinarea a doi sau trei compusi naturali, ca de ex. saruri (clorura de colina, acetat, bicarbonat, bitartrat etc.), zaharide (glucoza, fructoza, zaharoza etc.), alcooli (glicerol, sorbitol, xilitol, ribitol etc.), acizi organici (acid lactic, acid fitic, acid citric, acid malic, acid ascorbic etc.), aminoacizi, in diferite raporturi molare. NaDES cu clorura de colina si alcooli au fost printre cele mai eficiente pentru extractia enzimatica a acidului ferulic. Amestecurile eutectice binare care contin clorura de colina au fost preparate cu: etilenglicol in raport molar 1:2; 2,3-butandiol in raport molar 1:2;  1,4 butandiol in raport molar 1:2, precum si amestecuri eutectice ternare (cu apa) care contin clorura de colina: propilenglicol: apa si clorura de colina: 2,3-butandiol:apa in diferite raporturi molare, folosind componente cu puritate min. 99%.   (Enpro). Caracteristicile structurale si puritatea NaDES au fost investigate cu RMN (Rezonanta Magnetica Nucleara) si FTIR (Spectroscopie in infrarosu cu transformata Fourier) (ICECHIM)
• Pre-tratamentele cu NaDES care includ ChCl:Gly si ChCl:2,3 BD au fost cele mai eficiente in fractionarea paielor de grâu in trei componente majore: biomasa cu continut ridicat de celuloza, lignina si supernatant cu continut ridicat de acid ferulic. Pentru zaharificarea si fermentarea  biomasei imbogatite in celuloza a fost selectat un consortiu microbian. Acest consortiu include doua tulpini de Trichoderma,  T. asperellum  T36b NCAIM F 001434 si  T. harzianum  Td50b NCAIM F001412 si o tulpina de  Paenibacillus graminis  FL400, NCAIM B 001365. A fost optimizat procedeul experimental pentru recuperarea eficienta a 2,3-BD din amestecul de produsi rezultat in urma procesului fermentativ. PE elaborat consta in urmatoarea succesiune de operatii: (i) extractia produsului rezultat din fermentatie, la temperatura mediului ambiant (20-25C) si la presiunea atmosferica, cu alcool oleic folosit intr-un raport final alcool oleic: produs de fermentatie: 3:1 (v/v); (ii) separarea fazei apoase inferioare si colectarea extractelor organice; (iii) distilarea extractelor organice colectate intr-o coloana de fractionare, la vid, pentru recuperarea 2,3-BD si a alcoolului oleic care se refoloseste in extractie. Utilizarea acidului oleic permite recuperare biomasei de P. graminis si utilizarea acesteia ca biostimulant (ICECHIM).
• Pentru respectarea reglementarilor europene privind siguranta mediului, a fost evaluata toxicitatea solventilor naturali eutectici (NaDES) selectati, a levigatelor din pre-tratament si a extractului de acid ferulic fata de organismele acvatice prin utilizarea unei  game de diferite bioteste ecotoxicologice, standardizate, si nestandardizate (NIVA).
• In general, etalina a fost mai toxica pentru organismele acvatice decât glicelina, fara nicio diferenta evidenta intre speciile marine si cele de apa dulce. Raspunsul cel mai sensibil a fost observat la copepodul marin Tisbe battagliai cu valorii ale LC50 (concentratie care determina mortalitatea la 50% din populatie) de 0,025 si, respectiv, 0,033% din concentratia initiala de etalina si glicelina. Aceasta a fost echivalenta cu o dilutie de aproximativ 4000 de ori si, respectiv, de 3000 de ori a solutiilor originale de etalina si glicelina (NIVA)
• Investigatiile pentru a determina genotoxicitatea si citotoxicitatea NaDES au fost realizate prin utilizarea unei selectii de linii celulare umane comerciale TK6, HepG2, LNcap si pe celule de hamster chinezesc V79. S-au realizat bioteste  de tip comet-assay si de citotoxicitate tripan albastru. Celulele au fost expuse timp de 3 si 24 ore utilizând intervalul de dilutie a probelor de la 0,0625 % la 10 %. S-a demonstrat ca cel mai toxic compus a fost amestecul de etalina si acid ferulic, in special pentru celulele HepG2 (hepatice) si LNCap (adenocarcinom de prostata) (NGT).
• Tulpinile de Trichoderma de biostimulant pentru plantelor determina proliferarea cloroplastelor  (figura 3)  si intensificarea fotosintezei si a eficientei utilizarii apei.  Bioprodusul pe baza de P. graminis are efect de ameliorare a
• nodularii plantelor de fasole de catre rhizobii (ICECHIM).

Aspecte ultrastructurale ale celulelor parenchimului spongios din frunzele de P. caerulea dupa 60 de zile de la primul tratament cu biostimulanti pentru plante; 1a-c – C, control (fara tratament cu biostimulanti pentru plante, tratati numai cu apa); 2a-c – T1, tratament foliar cu suspensie de consortiu Trichoderma, 106  cfu/ml, echiv. la 1011  spori/ha; 3a-c – T2– tratament foliar cu suspensie Trichoderma, 108  cfu/ml, echiv. la 1013  spori/ha; 4a-c – T3– tratament foliar cu un produs de referinta, constând din extracte de plante, uleiuri esentiale si acizi grasi intr-o emulsie ulei/apa si extract din alge marine Ascophyllum nodosum, echiv. la 3 L/ha. Ch – cloroplast; Va – Vacuole; St – Boabe de amidon; N – nucleu; a, b, c- mariri diferite.

• Cerere de brevet, Oancea, F., Constantinescu-Aruxandei, D., Raut, I. , Calin, M.,  Procedeu de stimulare a producerii de 2,3 butan-diol in timpul fermentatiei semi-solide, RO133468 A1 (Etapa:1) 
• Cerere de brevet, Oancea, F., Constantinescu-Aruxandei, D., Raut, I. , Calin, M.,  Procedeu de inalt randament pentru testarea activitatii de biostimulant pentru plante, RO132587 (Etapa:1) 
• Cerere de brevet, Oancea, F., Constantinescu-Aruxandei, D., Bala, I.A, Barbieru, O., Tritean, N., Procedeu de zaharificare si fermentatie secvential simultana pentru producerea de 2,3 butandiol din material lignocelulozic a00860/2019 (Etapa:2) 
• Cerere de brevet, Oancea, F., Constantinescu-Aruxandei, D., Bala, I.A, Raut, I. , Calin, M., Dimitriu, L., Metoda pentru selectia tulpinilor microbiene producatoare de stereoizomeri ai 2,3 butandiolului, a00861/2019 (Etapa:2) 
• Cerere de brevet, Oancea, F., Constantinescu-Aruxandei, D.,  Nicolae, C.V., Negoi, A., Mihaila, E.G., Solventi eutectici cu toxicitate redusa pentru plante a00865/2019, (Etapa:2) 
• Articol, sesan, T. E., Oancea, A. O., stefan, L. M., Manoiu, V. S., Ghiurea, M., Raut, I., Constantinescu-Aruxandei, D.,  & Oancea, F. (2020), Effects of Foliar Treatment With a Trichoderma Plant Biostimulant Consortium on Passiflora caerulea L. Yield and Quality, Microorganisms, 8(1), 123 (Etapa:2) 
• Articole, Dinu, S., Cornea, P.C., Boiu-Sicuia, O.A, Lupu C., Oancea F., 2020, Microbial plant biostimulant effect of Paenibacillus graminis FL400 on common bean, Microorganisms, 8(10), 182 (Etapa:2) 
• Articol, Zamfiropol-Cristea, V., Trica, B., Constantinescu-Aruxandei, D., Oancea, F. Techno-economic analysis of the combined downstreaming process - 2,3 butandiol extraction assisted distillation and bacterial biomass recovery for plant biostimulant preparation, PROCESSES, (Etapa:3) 
• Articol, Zamfiropol-Cristea, V., Vladulescu, L., Constantinescu-Aruxandei, D., Oancea, F., Life Cycle Analysis of Integrated Production of Ferulic Acid, 2,3 Butanediol and Microbial Plant Biostimulants from Lignocellulosic Biomass by a Two-Step Cascading Process, Proceedings, 2020, 57, 16. (Etapa:3) 
• Articol, Zamfiropol-Cristea, V., Trica, B., Constantinescu-Aruxandei, D., Oancea, F, Optimization of 2,3 butandiole production with a Paenibacillus graminis strain, AgroLife Scientific Journal, in press (Etapa:3) 
• Articol, Gomez, T., Constantinescu-Aruxandei, D., Oancea, F, Shaposhnikov, S., Brooks, S., 2021,Enhancement of ferulic acid effects on microalgae by deep eutectic solvents, Chemosphere, in preparation (Etapa:3) 
• Articol, Constantinescu-Aruxandei, D., Gomez, T., Oancea, F, Shaposhnikov, S., Brooks, S., Difference between deep eutectic solvents aqueous solutions and their components similar solutions – nanoclusters of molecular microheterogenity?, Environmental Science: Nano, in preparation (Etapa:3) 
• Constantinescu-Aruxandei, D., Oancea, F., Process intensification on Circular Bioeconomy - A practical approach5th International Symposium “Priorities of Chemistry for a Sustainable Development” PRIOCHEM, Bucuresti, 2019 (Etapa:2) 
• Produs - Biostimulant pentru plante sub forma granulara pe baza de Trichoderma 
• Produs - Biostimulant pentru plante sub forma de microemulsie pe baza de Paenibacillus